結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病 率和死亡率呈逐年上升趨勢，發(fā)病率在惡性腫 瘤中排名第 4 位，死亡率居第 5 位。手術(shù)、放 療、化療為結(jié)直腸癌主要治療方式，但毒副作用較 大，預(yù)后效果不佳，故尋找毒副作用較小的高 效藥物具有重要意義。

1 材料

人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞 NCM460、人結(jié)腸癌細(xì)胞 SW620 購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心 ( CCTCC) 。 胎牛血清、ＲPMI-1640 培養(yǎng)基、二甲基亞砜 ( DMSO) 購自美國 Gibco 公司; 槲皮素、胰蛋白酶購 自北京索萊寶科技有限公司; BCA 試劑盒、PBS 緩 沖 液、 MTT 試 劑 盒 購 自 美 國 Sigma 公 司; Transwell 小 室 購 自 美 國 Corning 公 司; β-actin、 STAT3 一抗購自英國 Abcam 公司; HＲP 二抗購自 上海 碧 云 天 生 物 科 技 公 司; Trizol 試 劑、 Lipofectamine TM 2000、SDS-PAGE 試劑盒購自美 國 Invitrogen 公司; TaKaＲa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定 量試劑 盒 購 自 寶 生 物 工 程 ( 大 連) 有 限 公 司; PVDF 膜購自美國 Millipore 公司; ABI-7300 實時熒 光定量 PCＲ 儀購自上海普迪生物技術(shù)有限公司; NanoDrop 微量核酸測定儀購自美國賽默飛世爾科 技公司; 凝膠成像分析儀購自柯達(dá)公司。

2 方法

2. 1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

含 10%胎牛血清的 ＲPMI1640 培養(yǎng)基于 37 ℃、5% CO2 下培 養(yǎng) NCM460、 SW620 細(xì)胞，每 2 d 換液 1 次，細(xì)胞匯合度達(dá)到 80%后用 0. 25% 胰酶消化并傳代，待細(xì)胞生長狀 態(tài)穩(wěn)定后取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗。收集匯 合度約 50%的 SW620 細(xì)胞，按照 Lipofectamine TM 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書 分別加入轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 與 si-NC、 si-STAT3、 pcDNA、 STAT3，并依次標(biāo)記為 si-NC 組、si-STAT3 組、槲 皮素+pcDNA 組、槲皮素+STAT3 組。

2. 2 給 藥 及 分 組

DMSO 溶 解 槲 皮 素，配 成 20 mmol /L貯備 液，于 － 20 ℃ 下 保 存，使 用 時 用 ＲPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋，用于細(xì)胞培養(yǎng)。將其加入 到 SW620 細(xì)胞培養(yǎng)液中，槲皮素終濃度分別為 0、 25、50、100 μmol /L，重復(fù) 5 次，各組細(xì)胞置于上海博迅BPX-82電熱恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2 下 常 規(guī) 培 養(yǎng) 24 h， 50 μmol /L槲皮素處理的細(xì)胞分別培養(yǎng) 0、24、48、 72 h，每組重復(fù) 5 次。

2. 3 細(xì)胞存活率檢測

采用 MTT 法。取槲皮素 0 μmol /L 組、 25 μmol /L 組、 50 μmol /L 組、100 μmol /L組，si-NC 組，si-STAT3 組細(xì)胞，在轉(zhuǎn) 染后的槲皮素+pcDNA 組和槲皮素+STAT3 組細(xì)胞 培養(yǎng)液中加入槲皮素，調(diào)整終濃度為 50 μmol /L。 培養(yǎng) 24 h 后，各組細(xì)胞加入 20 μL MTT 孵育 4 h， 棄去 培 養(yǎng) 基，每 孔 加 150 μL DMSO，振 蕩 溶 解 10 min，酶 標(biāo) 儀 檢 測 490 nm 波長處各孔光密度 ( OD) 值，計算存活率，公式為存活率= ( 實驗組 OD 值/對照組 OD 值) ×100%。

2. 4 細(xì)胞遷移和侵襲檢測

采用 Transwell 法。各 組細(xì)胞加入 2. 5 μg /mL 絲裂霉素 C 干預(yù) 24 h 以抑 制細(xì)胞分裂，培養(yǎng)結(jié)束后加入適量胰酶消化，PBS 緩沖液清洗后用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度 為 3×104 /mL，取 200 μL 接種于包被、未包被基質(zhì) 膠的小室中，放到含完全培養(yǎng)基的下室中常規(guī)培養(yǎng) 24 h，棄去多余培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗滌后加入 4%多聚甲醛固定 30 min，0. 1%結(jié)晶紫染色10 min， 顯微鏡觀察并隨機選取 6 個視野拍照，計數(shù)。

2. 5 STAT3 mＲNA 表達(dá)檢測

采用 ＲT-PCＲ 法。 收集各組對數(shù)生長期的細(xì)胞，充分研磨后加入 Trizol 試劑提取總 ＲNA，NanoDrop 微量核酸測定儀 檢測 ＲNA 純度和濃度，凝膠電泳系統(tǒng)檢測 ＲNA 完 整性。TaKaＲa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 ＲNA 反 轉(zhuǎn) 錄 成 cDNA，按照 TaKaＲa 熒光定量試劑盒使用說明配 制反應(yīng)體系，以 β-actin 為內(nèi)參，置于 ABI-7300 實 時熒光定量 PCＲ 儀上進(jìn)行擴(kuò)增，每個樣品重復(fù) 3 次，引物序列見表 1，采用 2－ΔΔCt 法進(jìn)行分析

3 結(jié)果

與對照組 ( 0 μmol /L) 比較，50、100 μmol /L槲皮素處理后細(xì)胞存活率顯著降低 ( P＜0. 05) ，考 慮到成本方面，選擇 50 μmol /L; 與對照組 ( 0 h) 比較，50 μmol /L 槲皮素處理 24、48、72 h 后其存 活率也顯著降低 ( P＜0. 05，P＜0. 01) ，考慮到效率 方面，選擇 48 h。與對照組比較，槲皮素組 STAT3 蛋白表達(dá)顯著下調(diào) ( P ＜ 0. 05) ，而過表達(dá) STAT3 后槲皮素+STAT3 組蛋白表達(dá)顯著上調(diào) ( P＜ 0. 05) ; 槲皮素組細(xì)胞存活率、遷移數(shù)目、侵襲數(shù) 目顯著降低 ( P＜0. 05) ，而過表達(dá) STAT3 后槲皮 素+STAT3 組生存、遷移、侵襲能力顯著增強 ( P＜ 0. 05) 。



 

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