糖尿病腎病( diabetic nephropathy，DN) 是糖尿病微血管并發癥的主要并發癥之一，并且是導致終末期腎病( end stage renal disease，ESＲD) 的主要原 因。DN 的主要病理變化包括腎小球肥大、腎小 球基底 膜 增 厚、細胞外基質積聚以及腎纖維化等。腎小管上皮細胞-間質細胞轉分化( epithelial-mesenchymal transition，EMT) 是導致腎纖維化的 重要機 制 之 一。

1 材料

1． 1 儀器

上海博迅HPX-9272MBE電熱恒溫培養箱 ; 酶標儀( 美國 BioTek 公司) ; 高速冷 凍離心機( 美國 Sigma 公司) ; 倒置顯微鏡( 日本 Olympus 公司) ; 超凈工作臺( 蘇凈集團蘇州安泰空氣 技術有限公司) ; 脫色搖床( 海門市麒麟醫用儀器 廠) ; Western 電泳-轉印電源( 美國 Bio-Ｒad 公司) ; 半干轉印系統( 美國 Bio-Ｒad 公司) ; 雙紅外激光成 像系統( Odyssey 公司) 。

1． 2 試藥

大黃素( 徐州醫科大學藥學院實驗室 提取) ，純度檢測見結果“3． 1”。DMEM 培養基( 美 國 Invitrogen Gibco 公司，ＲEF31600-034) ; 雷帕霉素 ( 美國 CST 公司，貨號: 9904s) ; p-mTOＲ( Ser2448) 抗 體( 美國 CST 公司，貨號: 5536) ; p-P70S6K 抗體( 美 國 CST 公司，貨號: 9234) ; 兔抗 α-SMA 單克隆抗體 ( 貨號: 1184-1) ; 兔抗 E-Cadherin 單克隆抗體( 貨 號: 5409-1) ( Abcam 公司) ; β-actin 抗體( 美國 Biworld 公司，貨號: AP0060) ; 胎牛血清( 依克賽公司， 批號 FSPl00) ; 熒光二抗( 奧德賽公司，批號 C40721- 02) ; 抗熒光猝滅封片液( 編號: P0126) 、PMSF( 編 號: ST506) ( 碧云天生物技術研究所) 。青霉素-鏈 霉素溶液( 100 × ，編號: C0222) 、BCA 蛋白濃度測定 試劑盒( 編號: P0010) 、Western 一抗稀釋液( 編號: P0023A) 、Western 二抗稀釋液( 編號: P0023D) 、ＲAPI 裂解液( 編號: P0013B) 均購自于碧云天生物技術 研究所。

1． 3 藥液配制

精密稱取雷帕霉素 18． 28 mg，溶 解于 1 mL DMSO 中，配制成濃度為 20 mmol·L － 1 的 母液分裝，稀釋為 20 μmol·L － 1 的二級母液保存。 給藥時每 1 mL 培養基加入 1 μL 濃度為 20 μmol· L － 1 的雷帕霉素，使得培養液雷帕霉素的終濃度為 20 nmol·L － 1 。大黃素用 DMSO 配成 50 mmol·L － 1 母液，-20 ℃保存。臨用前用 DMEM 高糖稀釋成 1， 2． 5，5，10，20，40，80，160 μmol·L － 1 。

1． 4 實驗細胞

人近端腎小管上皮細胞( HK-2) ， 購自上海復祥生物科技有限公司( 來源于 ATCC， CＲL-2190) ，購入后接種于含 10% 新生牛血清、1 × 105 U·L － 1 青霉素、100 mg·L － 1 鏈霉素、3． 7 mg·L － 1 碳酸氫鈉的 DMEM 培養液中，于 37 ℃、5% 二氧化 碳，培養箱中培養，每 2 ～ 3 d 傳代 1 次。

2 方法

HK-2 細胞以適當密度接種，同 步化 12 h 后，分為正常組( NG 組，5． 56 mmol·L － 1 葡 萄糖) 、甘露醇組( MA 組，5． 56 mmol·L － 1 葡萄糖 + 54． 44 mmol·L － 1 甘露醇) 、高糖組( HG 組，60 mmol· L － 1 葡萄 糖) 、溶 劑 組 ( 5． 56 mmol·L － 1 葡 萄 糖 + 0． 1% DMSO) 、大黃素組( EMO 組，60 mmol·L － 1 葡萄 糖 + 10 μmol·L － 1 大黃素) 和 mTOＲ 抑制劑組( Ｒapamycin 組，60 mmol·L － 1 葡萄糖 + 20 nmol·L － 1 雷帕霉 素) 。用 DMEM 培養 基制成 4 × 107 /L 細胞懸液，接種于 96 孔培養板，培 養 24 h 棄上清，加人無血清正常 DMEM 培養基，同 步化 12 h 后，在正常 DMEM 的基礎上給予不同濃度 的大黃素，培養 72 h 后，每孔加入 MTT 溶液 20 μL， 于 37 ℃、5% 二氧化碳，培養箱中孵育 4 h 后，用酶 標儀在波長 490 nm 處測定各孔光密度值( D) ，實驗 重復 3 次。HK-2 細胞按各處理因素處理 72 h 后，冰上裂解、提 取細胞總蛋白，采用 BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白 濃度。取 55 μg 蛋白上樣量，經 8% 的 SDS-PAGE 電泳，用電轉印法將凝膠上的蛋白轉移至 NC 膜，室溫 封閉 1 h，加抗 p-mTOＲ、p-P70S6K、p-4-EBP1、E-cadherin、α-SMA 抗體( 1 1 000) ，4 ℃ 過夜，PBST ( 5 min /3 次) ，充分洗滌后，孵熒光二抗( 11 000) ，室 溫 1 h，Odyssey 儀器拍照，Image J 軟件分析條帶灰 度值。應用 SPSS 17． 0 統計軟件處理， x ± s 表示，2 組間比較采用 t 檢驗，多組間比較采用 單因素方差分析( one-way ANOVA) ，若數據不符合 方差齊性，則采用 Dunnett’s T3 檢驗。P ＜ 0． 05 表 示差異有顯著性。

3 結果

色譜柱: Agilent ZOＲBAX SB-C18 ( 4． 6 mm × 250 mm，5 μm) ; 流 動相: methanol-water ( 7525，phosphoric acid adjusted pH 2． 8 ) ; 檢 測 波 長: 225 nm; 流 速: 1． 0 mL· min － 1 ; 柱溫: 35 ℃甘露醇組與正常組比較差異無顯 著性( P ＞ 0． 05) ; 溶劑組與正常組比較差異無顯 著性( P ＞ 0． 05) ; 1，2． 5，5，10 μmol·L － 1 EMO 與 正常組比較差異無顯著性 ( P ＞ 0． 05 ) ; 20，40， 80，160 μmol·L － 1 EMO 與正常組比較差異有顯著性( P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ，提示大黃素濃度為 1，2． 5，5，10 μmol·L － 1 對正常培養的細胞毒性很 小。考慮到大黃素對高糖誘導的腎小管 EMT 的 抑制作用，故選擇對正常細胞生長無影響的 10 μmol·L － 1 作為干預濃度。正常培養的 HK-2 細胞呈現典型的鵝卵石鋪路 樣分布，高糖培養的 HK-2 細胞形態從正常的圓形 或橢圓形轉變為長梭形的纖維化樣形態，給予大黃 素培養后，細胞形態逐漸變回橢圓形，給予雷帕霉 素后細胞同樣由長梭形變成橢圓形或鵝卵石鋪 路樣。

4 討論

DN 是糖尿病較為常見的并發癥，其病理變化 呈慢性進行性進展，最終導致終末期腎衰竭和患者 死亡。DN 晚期常表現為腎小球硬化和腎間質纖維 化，其中腎小管 EMT 是腎間質纖維化的重要原因之 一。Iwano 等實驗證明，腎間質纖維化的間充 質細胞，36% 來源于腎小管上皮細胞，說明 EMT 是 間質成纖維細胞的主要來源，也是腎間質纖維化的 中心環節。mTOＲC1 的異常激活參與了糖尿病狀態 下多個病理進程包括 DN，以及腎纖維化等。



 

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