醬油是以大豆（或豆粕）、小麥（或麩皮）為主 要原料，以米曲霉制曲，加食鹽發(fā)酵而成的一種 調(diào)味品。 早期，醬油生產(chǎn)以天然混菌發(fā)酵為主。 上 世紀(jì) 60～70 年代，為了提高氨態(tài)氮得率等指標(biāo)，逐 步過(guò)渡到米曲霉純種發(fā)酵。 上世紀(jì)末，醬油企業(yè)為 了改善醬油的風(fēng)味，又紛紛嘗試添加魯氏酵母菌、 球擬酵母和乳酸菌發(fā)酵來(lái)提高醬油品質(zhì)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

豆粕、麩皮、AS3.042 米曲霉，老恒河釀造有限 公司；AS2.180 魯氏酵母、 滬釀 2.14 球擬酵母、滬 釀 1.08 乳酸菌， 上海迪發(fā)有限公司； 氫氧化鈉， 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；濃鹽酸（36%～ 38%），衢州恒化試劑有限公司；濃硫酸，衢州恒化 試劑有限公司； 葡萄糖， 廣東光華化學(xué)廠有限公 司；硫酸鉀，上海振新試劑廠；乙酸、3-甲基丁醛、 丁醇、乙酸乙酯、3-辛醇（內(nèi)標(biāo)），Alfa aecer 公司； 甲 醛（36%），杭州高晶精細(xì)化工有限公司；氯 化 鈉，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博迅；8HW-1 型 恒溫磁力攪拌器，科大創(chuàng)新；pHS-3C 型酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠；電子天平，上海精科；電子分析天 平，上海精科；721 可見分光光度計(jì)，上海精密科 學(xué)儀器有限公司；TN303-4 恒溫培養(yǎng)箱，南京市江 寧電器儀器廠；3-Octanol（內(nèi)標(biāo)），Alfa aecer 公司； 30 m ×0.25 mm ×0.25 μm 毛 細(xì) 管 色 譜 柱 ；75 μm Carboxen/PDMS 萃 取 頭 ；Agilient 5975C 氣 相 色 譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；手動(dòng) SPME 進(jìn) 樣器。

1.3 方法

以 6∶4（w/w）的比例把原料豆粕與麩 皮均勻混合。 然后經(jīng)過(guò)潤(rùn)水、蒸煮、冷卻三個(gè)步驟 后， 按接種量為 0.3%接種滬釀 3.042 米曲霉單菌 種制曲。 在 35～37 ℃下，制曲 46 h。 1.3.2 醬油發(fā)酵 設(shè)置 4 個(gè)組，Ⅰ組為對(duì)照組，其 余Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3 組為試驗(yàn)組。 每組稱取成曲 10 kg， 然后與濃度為 19 °Bé 的鹽水按照 1 ∶ 2 （曲 ∶ 鹽水 w/w）的比例混合，進(jìn)行發(fā)酵，溫度為室溫。 按照 表 1 的試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。 發(fā)酵開始的當(dāng)天設(shè)為 0 d 開始取樣，之后每隔 10 d 取樣一次，測(cè)定在不 同時(shí)間段醬油發(fā)酵過(guò)程中理化指標(biāo)的變化。 到 90 d 結(jié)束取樣。

2 結(jié)果與討論

對(duì)醬油中的氨基酸態(tài)氮含量、 糖化酶含量、 pH 值、還原糖含量與發(fā)酵天數(shù)的關(guān)系用 Origin 8 軟件進(jìn)行擬合， 可以得到醬油的理化指標(biāo)與發(fā)酵 時(shí)間的函數(shù)。 醬油的 pH 等理化指標(biāo)與發(fā)酵時(shí)間 的擬合曲線見圖 1～圖 3。

由圖 1 可知， 發(fā)酵 90 d， Ⅳ組添加了魯氏酵 母、 球擬酵母和乳酸菌制曲的醬油氨基酸態(tài)氮含 量最高，可達(dá)到 1.38 g/100 mL，Ⅰ組最低。 在發(fā)酵 過(guò)程中氨基酸態(tài)氮的含量趨勢(shì)呈現(xiàn)先增加后平 穩(wěn)。 在 50 d 以前，對(duì)照組高于試驗(yàn)組，50 d 后對(duì)照 組中的氨基酸態(tài)氮含量基本趨于平穩(wěn)。 而試驗(yàn)組 中的氨基酸態(tài)氮在前 60 d 一直保持上升趨勢(shì)，直 至 60 d 時(shí)才趨于平穩(wěn)。 這是由于添加魯氏酵母與 球擬酵母后，在前期酵母大量繁殖，消耗較多氨基 酸。 因此在 30～50 d 時(shí)，試驗(yàn)組中的氨基酸態(tài)氮低 于對(duì)照組。 而 50 d 后，由于對(duì)照組中的氨基酸與 糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)消耗氨基酸， 而試驗(yàn)組中的 這一過(guò)程發(fā)生在 60 d 后。由圖 2 可知，pH 呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢(shì)，這 是由于在發(fā)酵過(guò)程中， 由于醬油中有機(jī)酸的不斷 產(chǎn)生。明顯可以看出，pH 下降最快的為Ⅳ組。這是 由于Ⅳ組添加了乳酸菌，乳酸菌可以利用糖類、檸 檬酸生成乳酸和醋酸， 從而產(chǎn)生以上現(xiàn)象。 并且pH 下降至 5 附近， 抑制了非耐酸雜菌的生長(zhǎng)，同 時(shí)促進(jìn)酵母的繁殖與發(fā)酵。 另外，酸性物質(zhì)賦予了 醬油爽適的風(fēng)味，改善醬油的口感。 并且酸性物質(zhì) 的生成抑制了非耐酸微生物的繁殖， 但可以促進(jìn) 醬油酵母的生長(zhǎng)與繁殖，以及酒精發(fā)酵。由圖 3 可知，在發(fā)酵過(guò)程中，還原糖的含量呈 現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象。 這是由于制曲時(shí)積累的 淀粉酶作用下，還原糖含量上升，和可利用多糖的 釋放。 而后期，由于美拉德反應(yīng)以及微生物代謝 消耗還原糖，導(dǎo)致還原糖含量下降。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)添加不同菌種組合發(fā)酵所得醬油的理 化指標(biāo)以及風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定， 發(fā)現(xiàn)多菌種制曲高鹽稀態(tài)發(fā)酵的醬油特征風(fēng)味物質(zhì)含量更高， 品質(zhì) 更好。 發(fā)酵過(guò)程中：（1）4 組的氨基酸態(tài)氮、 還原 糖、pH 等理化指標(biāo)基本相似， 第Ⅳ組的氨基酸態(tài) 氮的值（1.378 g/100 mL）略 高 于 其 他 3 組；（2）魯 氏酵母促進(jìn)了醬油中高級(jí)醇及芳香雜醇的生成， 球擬酵母促進(jìn)了醬油中 4-EG、4-VG 的 生 成，使 醬油具有特殊的香氣， 乳酸菌發(fā)酵賦予了醬油爽 適的口感， 各組風(fēng)味物質(zhì)含量和種類差異非常顯 著；（3）對(duì)特征性風(fēng)味物質(zhì)含量與發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行曲 線擬 合，可得到數(shù)學(xué)關(guān)系式（如 y=-230.83+21.7 t-0.136 t 2 +1.27×10-4 t 3 ，第Ⅰ組），從關(guān)系式算出Ⅰ 組特征性風(fēng)味物質(zhì)最大值分別為：648.96 μg/L（Ⅰ 組，發(fā)酵周期 92 d）、852.90 μg/L（Ⅱ組，發(fā)酵周期 98 d）、982.51 μg/L（Ⅲ組，發(fā)酵周期 99 d）、1 897.55 μg/L（Ⅳ組，發(fā)酵周期 102 d）。 多菌種發(fā)酵的醬油 獲得了較高的特征性風(fēng)味物質(zhì)含量。 以上結(jié)果，對(duì) 醬油的多菌混合制曲發(fā)酵實(shí)踐生產(chǎn)中有一定指導(dǎo)意義。