咳嗽是人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ姷囊环N現(xiàn)象，它是人體的 一種應激反應，目前，其發(fā)病機制尚不完全明確，相關文獻 報道稱咳嗽或者與氣道炎癥反應、氣道黏膜損傷等因素有干系。呼 吸 道 合 胞 體 病 毒 ( respiratory syncytial virus， ＲSV) 是一種常見的冬季呼吸道病毒，影響所有年齡段的 人，是幼兒嚴重下呼吸道感染的主要原因。然而，ＲSV 在成 人中也是一種重要的病原體，特別是在老年人、慢性肺部疾 病患者或免疫功能受損的人群中。現(xiàn)代醫(yī)學認為病毒 感染導致了氣道變應性炎癥、氣道上皮損傷、氣道高反應等。

1 材料與方法

1． 1 實驗動物

清潔級豚鼠，雌性，體質(zhì)量 300 ～ 450 g，購自北京實驗 動物中心，動物使用許可證號: SYXK( 遼) 2012 － 0003。

1． 2 主要試劑及儀器

1． 2． 1 射干及提取物制備

射干藥材購自亳州市星躍藥 業(yè)有限責任公司，由遼寧中醫(yī)藥大學植物教研室王冰教授 鑒定為鳶尾科射干 Belamcandachinensis( L． ) Ｒedouté 的干 燥根莖。射干提取物的制備: 取射干片加 70% 乙醇，回流 提取 3 次，第 1 次加 8 倍量，第 2 次和第 3 次分別加 6 倍 量，每次提取 1 h，趁熱濾過，合并提取液，回收乙醇，濃縮成 稠膏，干燥，粉碎成細粉。

1． 2． 2 試劑

肺寧片購自吉林吉春制藥股份有限公司 ( 20140206) ; Hep － 2 人喉表皮癌細胞購自江蘇齊氏生物科 技有限公司; ＲSV 由中科院武漢病毒所贈予; DMEM 培養(yǎng) 液和胎牛血清購自 COＲNING 公司; DMSO 購自美國 Sigma 公司; 胰酶和青鏈霉素購自中國醫(yī)學科學院生物工程研究 所; 色譜級醋酸銨、色譜級甲醇和色譜級乙腈購自德國默克 公司; Cis － 5，8，11，14 － Eicosic Acidtraenoic Acid ( AA) ( 批 號: U － 71A － F2 － Z) 和 Arachidonic Acid － d8 ( AA － d8) ( 批號: 0465985 － 16) 購自美國 Cayman Chemical 公司。

1． 2． 3 主要儀器

噴霧儀( EM99 － 002，惠州斯萊達) ; 全 自動模塊式血液體液分析( XN － 1000，日本 Sysmex 公司) ; 熏煙箱( 自制) ; 三氣培養(yǎng)箱( CB210，德國 Binder) ; 倒置熒 光顯微鏡( XDS － 500C，上海蔡康) ; 超凈工作臺( SW － CJ － 2D，蘇州凈化) ; 低速離心機( BY － 400C，北京白洋) ; 立式蒸汽滅菌器( BXM-30R，上海博訊) ; LC － MS /MS 聯(lián)用儀 ( Agilent6410 型，美 國 Agilent) ; 微型旋渦混合儀 ( XW － 80A，上海滬西) ; 分析天平( XS105，瑞士 Mettler － Toledo) ; 超純水機( Milli － Q，德國默克) 等。

1． 3 實驗方法

1． 3． 1 病毒培養(yǎng)

Hep － 2 細胞在培養(yǎng)瓶中長至 70% ～ 80% 融合，吸出培養(yǎng)基，取病毒懸液 100 μL 接種于細胞上， 吸附 2 h 后倒出病毒液，加入 5% 胎牛血清的培養(yǎng)基，于第 2 ～ 3 天開始出現(xiàn)細胞病變( CPE) ，待病變達 60% ～ 70% 時 收獲病毒，細胞病變法( cytopathic effect，CPE) 測定病毒感 染滴 度，Ｒeed － Muench 公式計算病毒半數(shù)細胞感染量 ( TCID50 ) 。1 TCID50≈0． 7 空斑形成單位( plaque forming unit，pfu) 。

1． 3． 2 感染后咳嗽模型的制備

將豚鼠放入自制 450 mm × 450 mm × 900 mm 熏籠中，每 5 只 1 籠，以鋸末 50 g + 10 支香煙點燃煙熏，每次 30 min，每日 1 次，連續(xù) 7 d，自由 進食吸水，分別在第 2 天、第 3 天用乙醚淺麻醉 1 次，鼻腔 滴入已事先擴增凍存好的病毒液，病毒滴度為 8 × 106 pfu / mL，滴入量以體質(zhì)量 1 μL/g 計算。

1． 3． 3 實驗動物分組及給藥方法

將 40 只 SPF 級豚鼠適 應性飼養(yǎng) 1 周后，隨機分為 4 組，即空白組、模型組、射干組 ( 600 mg·kg － 1 ·d － 1 ) ，陽性組( 肺寧片 512 mg·kg － 1 ·d － 1 ) ，每組 10 只。按“1． 3． 2”制備感染后咳嗽動物模型， 除模型組外，其它各給藥組在第 8 天時開始給藥，每天 1 次，連續(xù)給藥 7 d，空白組給予等體積生理鹽水。

1． 3． 4 對實驗動物鎮(zhèn)咳作用的觀察

于末次給藥 45 min 時，將動物置于 5 L 大燒杯中，底部加少量墊料，燒杯口用 保鮮膜封，以 4． 5 mol /L 枸櫞酸溶液霧化吸入激發(fā)，每次 30 s，觀察 5 min 內(nèi)豚鼠咳嗽次數(shù)。

2 結果

除空白組外，各組的肺組織均漿液在 Hep － 2 細胞上 培養(yǎng)至第 2 天細胞開始逐漸腫脹、變圓和聚集，細胞間隙增 大，第 4 天形成多核巨細胞或稱融合細胞。提示 ＲSV 病毒 感染成功。模型組豚鼠的咳嗽潛 伏期無顯著差異( P ＞ 0. 05) ，而 5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著高于 空白組( P ＜ 0. 01) ，提示造模成功。與模型組相比，給藥組 中，射干組和陽性組豚鼠 5 min 內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著降低( P ＜ 0. 05) ，陽性組豚鼠 5 min 后咳嗽次數(shù)顯著下降( P ＜ 0. 05) ， 提示射干提取物對豚鼠 ＲSV 感染后氣道炎癥具有顯著的 鎮(zhèn)咳作用。空白組鏡下肺組織和肺泡結構正常， 有完整的支氣管上皮，黏膜較光滑，各層的結構比較清晰， 在支氣管壁內(nèi)側未見到炎癥細胞的浸潤; 模型組在鏡下觀 察到顯著地支氣管、支氣管周圍炎癥，其血管周圍有很多炎 性細胞浸潤，觀察到支氣管黏膜充血水腫，管腔內(nèi)有上皮細 胞脫落，有纖毛倒伏上皮現(xiàn)象，明顯可見中性粒細胞和淋巴 細胞有圍管性浸潤; 而射干組和陽性組與模型組比較，支氣 管和周圍炎癥較上述病理變化均有所減輕，提示射干提取 物對呼吸道合胞病毒感染后氣道肺組織損傷有一定的治療 作用。

3 討論

感染后咳嗽又稱為“感冒后咳嗽”，是指呼吸道 感染發(fā)熱等急性期癥狀消失后，咳嗽仍遷延不愈，可持續(xù) 3 ～ 8 周的時間，呈喉癢、干咳或咳少量白色黏液痰，血常規(guī)、 C 反應蛋白、胸片提示無異常，是呼吸道感染后常見的并發(fā) 癥。西醫(yī)認為該病為自限性疾病，很多權威學者一致認 為炎癥因素、氣道上皮損傷、氣道高反應性、神經(jīng)因素等是 感染后咳嗽的發(fā)病機制，通常經(jīng)過長時間自行緩解或予經(jīng) 驗性治療可愈。



 

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