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霉菌培養(yǎng)箱在金針菇中的作用！

來(lái)源：未知發(fā)布日期：2019-07-26 16:37【大中小】

本文對(duì)影響金針菇原生質(zhì)體制備和再生的因素進(jìn)行研究,并篩選出金針菇原生質(zhì)體制備和再生的最佳條件,為采用細(xì)胞工程技術(shù)培育金針菇優(yōu)良菌種打下了基礎(chǔ)。

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不同的接種方法對(duì)原生質(zhì)體的再生有很大的影響,本實(shí)驗(yàn)上海博訊分別采用直接涂抹法和雙層培養(yǎng)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),雙層培養(yǎng)法幾乎沒(méi)有菌落再生。原因可能是冬季操作,雙層培養(yǎng)基的上層半固體培養(yǎng)基溫度難以控制,致使原生質(zhì)體死亡。

原生質(zhì)體雖然失去了細(xì)胞壁存在時(shí)的原有細(xì)胞形態(tài),變成了圓球體,但它仍然具有原生質(zhì)膜和整體基因組,仍保持著細(xì)胞的生理學(xué)、生化學(xué)和遺傳學(xué)的特性和功能,并能再生和回復(fù)成一個(gè)具壁細(xì)胞,因此已成為生理學(xué)和遺傳學(xué)的研究材料。影響原生質(zhì)體形成的因素很多,本文上海博訊比較了酶濃度、酶系組合、滲透壓穩(wěn)定劑及酶解時(shí)間等因素的影響。用酶法破壁制取原生質(zhì)體,酶的作用無(wú)疑是關(guān)鍵,不同種或者同一種不同分布區(qū)域的菌體由于其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)可能存在差異而需要不同的酶系統(tǒng),而且,酶的質(zhì)量、純度對(duì)原生質(zhì)體的形成也有著非常大的影響。真菌細(xì)胞壁是由幾丁質(zhì)、纖維素和無(wú)定型葡聚糖層組合的復(fù)合體,因此在一般情況下,采用具有分解幾丁質(zhì)、纖維素的裂解酶即能制備出原生質(zhì)體。

本實(shí)驗(yàn)上海博訊采用纖維素單酶進(jìn)行裂解,發(fā)現(xiàn)需時(shí)較長(zhǎng),而且產(chǎn)量很低。采用纖維素酶與其它酶的混合體系則大大縮短了酶解時(shí)間,原因可能在于不同酶之間存在作用的互補(bǔ)。本實(shí)驗(yàn)上海博訊篩選出的最佳酶系組合是纖維素酶與溶菌酶的混合,并且分別以1%的濃度混合較為適宜。濃度過(guò)高,易造成原生質(zhì)體不穩(wěn)定而變形,甚至破裂,產(chǎn)量反而下降也不經(jīng)濟(jì);濃度太低,破壁困難則原生質(zhì)體產(chǎn)量不足。滲透壓穩(wěn)定劑作為裂解酶的作用環(huán)境和原生質(zhì)體的存在環(huán)境,對(duì)原生質(zhì)體的釋放和再生產(chǎn)生重要的影響。穩(wěn)滲劑的性質(zhì)、濃度一定程度上會(huì)促進(jìn)酶的反應(yīng)活性,同時(shí)也是維持和控制原生質(zhì)體數(shù)量的主要因素。常用的滲透壓穩(wěn)定劑有無(wú)機(jī)型和有機(jī)型兩大類,對(duì)食用菌來(lái)說(shuō),滲透壓穩(wěn)定劑用無(wú)機(jī)鹽似乎比有機(jī)型的要好。這可能與絲狀真菌原生質(zhì)體為保持代謝活性利用醇、糖而改變周圍環(huán)境,包括pH、滲透壓以至改變穩(wěn)定性,從而影響破壁效果有關(guān),這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致,并且以KCl為穩(wěn)滲劑的效果最好,可以獲得最高產(chǎn)量且原生質(zhì)體比較穩(wěn)定。

本次實(shí)驗(yàn)選用的三種無(wú)機(jī)鹽類穩(wěn)滲劑KCl、NaCl、MgSO4·7H2O對(duì)原生質(zhì)體的再生沒(méi)有明顯不同的影響,但是作者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)采用MgSO4·7H2O作穩(wěn)滲劑的培養(yǎng)基凝固性差。酶解時(shí)間也是影響原生質(zhì)體釋放的重要因素。上海博訊本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,25℃下,酶解1.5h獲得的原生質(zhì)體最多,大小也比較均勻,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),原生質(zhì)體數(shù)量開始減少,主要原因可能是酶繼續(xù)作用于膜系統(tǒng)使膜破裂所致。另外在酶解過(guò)程中,要間隔一段時(shí)間伴以輕微振蕩,以利于原生質(zhì)體與菌絲體分離開來(lái)。此外,酶解溫度和菌絲體的菌齡對(duì)原生質(zhì)體的釋放也產(chǎn)生了很大的影響。酶解溫度主要影響酶的活力和菌體的生理狀態(tài),由于金針菇菌絲生長(zhǎng)的最適溫度是25℃,纖維素酶和溶菌酶的酶活性最適溫度為25～35℃之間,所以作者采用的酶解溫度為25℃。菌絲體的菌齡對(duì)原生質(zhì)體釋放的影響主要在于細(xì)胞壁的成份和結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。酶解時(shí),首先菌絲頂端見(jiàn)到原生質(zhì)體釋放,因?yàn)榧舛瞬糠质切潞铣傻谋?成分相對(duì)簡(jiǎn)單,壁也相對(duì)薄些。隨著菌齡的增加,壁不斷沉積色素等物質(zhì),阻礙了酶的作用,使壁難以解體釋放原生質(zhì)體。

在本實(shí)驗(yàn)中,上海博訊采用搖瓶培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)較快,4d即可獲得大量菌絲。但是作者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)金針菇菌絲在搖瓶培養(yǎng)時(shí)易團(tuán)化,另外分泌粘性物質(zhì)很多,不利于洗滌和酶解。因此采用搖瓶培養(yǎng)的菌絲制備原生質(zhì)體時(shí),應(yīng)先采取措施使菌團(tuán)充分散化,使菌絲細(xì)胞壁外露,以利于隨后的振蕩洗滌及各種裂解酶的滲入而起作用。這將在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討。而采用玻璃紙平板培養(yǎng)的菌絲雖然生長(zhǎng)較慢,10d才能得到適用的菌絲,但制取原生質(zhì)體方便,效果較好。同樣,影響原生質(zhì)體再生的因素有很多本文進(jìn)行了培養(yǎng)基、滲穩(wěn)劑、接種方法等因素的影響的研究。培養(yǎng)基成分不同會(huì)導(dǎo)致新合成的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異,這種差異又導(dǎo)致了對(duì)酶敏感度反應(yīng)不一,從而使菌絲細(xì)胞釋放的原生質(zhì)體再生有差異。

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