抗生素的發現為人類對抗感染性疾病做出了巨 大的貢獻。但是近些年來隨著人們對抗生素的不 合理使用 甚 至 濫 用，直接導致大量耐藥菌的產生， 常規的抗菌藥物對于治療常見的細菌感染也愈發困難。蛇毒是從毒蛇腺體中分泌的一種液體，主要 成分為一些活性酶類、多肽及蛋白質，占毒液干重 ９０％～９５％，還含有部分脂肪、碳 水 化 合 物、金 屬 離子、核 苷、胺類以及游離氨基酸等。

１ 材料與方法

１．１ 實驗材料與試劑

１．１．１ 實驗菌株

金黃色葡萄球菌 （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ－ ｃｕｓａｕｒｅｕｓ，ＣＭＣＣ２６００３）、甲型溶血性鏈球菌 ［α－ Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，ＣＭＣＣ （Ｂ）３２２１３］、 枯 草芽胞 桿 菌 （Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ，ＣＭＣＣ６３５０１） 和 大腸埃希菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＣＭＣ４４１１３），以上 菌株均由廣西醫科大學微生物學教研室提供 （購自 中國食品藥品檢定研究院）。

１．１．２ 實驗藥品與試劑

廣西眼鏡蛇和五步蛇蛇毒 由廣西醫科大學蛇毒研究所提供，銀環蛇蛇毒購自 義烏市蛇毒研究所，ＭＨ 營養瓊脂、ＭＨ 肉湯培養 基粉由北京索萊寶科技有限公司提供，胎牛血清由 美國 ＧＩＢＣＯ 公司提供。

１．１．３ 實驗儀器

ＺＨＷＹ－１１１Ｂ型恒溫培養振蕩器 （上海智城分 析 儀 器 制 造 有 限 公 司），ＭＰＪ１５０型 霉 菌培養 箱 （上 海 科 恒 實 業 發 展 有 限 公 司），YXQ-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋 （上海博迅實業有限公司），ＭｉｃｒｏＣＬ１７Ｒ 型 高 速 低 溫 離 心 機 （德 國 ＴＨＥＲＭＯＩＥＣ公 司），ＣＸ３１＋ＤＰ７３型 倒 置 顯 微 鏡（奧林巴斯有限公司），ＴＶ－１９０１型紫外可見分光光 度計 （北京普析通用儀器有限公司），ＤＫ－９１４型恒 溫水浴鍋 （上海森信儀器有限公司）。

１．２ 實驗方法

１．２．１ 細菌培養

分別將甘油凍存的金黃色葡萄球 菌、甲型溶血性鏈球菌、大腸埃希菌和枯草芽胞桿 菌室溫 融 化 后，劃 線 接 種 至 ＭＨ 營 養 瓊 脂 平 板， ３７ ℃培 養 箱 培 養１８～２４ｈ，挑 取 典 型 菌 落 接 種 至 ＭＨ 肉湯培養基，３７ ℃恒溫振搖箱孵育１６～１８ｈ， 轉速２００ｒ／ｍｉｎ。

１．２．２ 細菌濃度標準曲線的繪制及菌懸液制備

將 孵育好的細菌室溫下１０００ｒ／ｍｉｎ （離心半徑４．３ｃｍ） 離心４５ｓ收集菌液，重復用無菌生理鹽水洗脫２次， 按倍數稀釋法用無菌生理鹽水依次稀釋原菌液作為 實驗組，其對應的無菌生理鹽水作為空白對照，利 用紫外分光光 度 計 測 定 細 菌 在６００ｎｍ 時 的 吸 光 度 （Ａ）值，以Ａ 值為橫坐標，菌液濃度為縱坐標，分 別繪制４種細菌的標準曲線，得到回歸方程。確定 所用原菌液濃度為１×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ 的 Ａ 值，然后 １∶１００用 ＭＨ 液體培養基稀釋至 １×１０６ ＣＦＵ／ｍＬ 備用。

１．２．３ 蛇毒儲存液配制

取３種蛇毒分別溶于無菌 生理鹽水中，濃度不低于初始實驗濃度的１０倍，經 ０．２２μｍ 無菌微孔濾膜過濾除菌，于－２０ ℃冷凍保 存備用。

１．２．４ ＭＩＣ測定

分別制備３種蛇毒的 ＭＩＣ 測定 板，首先在９６孔板所有的 Ｖ孔內依次加入 ＭＨ 肉湯 培養基各１００μＬ。其次，各在 Ｂ／Ｃ／Ｄ 三排的第１個 Ｖ 孔內加配好的蛇毒１００μＬ，使第１個孔內的初始 濃度為１２８０μｇ／ｍＬ，混勻后依次對藥物進行二倍 稀釋，即第１個孔中加入藥液后用移液槍充分吹打 使藥物 與 肉 湯 充 分 混 勻，然 后 吸 取 １００μＬ 加 入 第２個孔再充分吹打使之與肉湯充分混勻，照 此 重 復至最后一孔，混勻后從第１２列吸出１００μＬ棄掉。 最后，再在 Ｂ／Ｃ／Ｄ三排的每一孔中加入稀釋好的菌 液１０μＬ，使每個孔內菌液濃度為１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。 在 Ａ 排上做一排陰性對照 （只 加 ＭＨ 肉 湯 不 加 菌 液）和在 Ｈ 排上做一排陽性對照 （只加菌液不加藥 液），詳 見 表 １。將 ９６ 孔 板 放 入 ３７ ℃ 恒 溫 培 養 箱 （內置濕盤保持濕度）培養。

１．２．５ ＭＩＣ值 結 果

讀 取 分別觀測讀取培養 ２４、 ４８和７２ｈ后的 ＭＩＣ５０、ＭＩＣ８０和 ＭＩＣ１００結果，當陽 性對照孔內細菌明 顯生長時， 采用目測法讀取 ＭＩＣ５０、ＭＩＣ８０和 ＭＩＣ１００數值。以肉眼能觀察到在小 孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度 為 ＭＩＣ１００； 以肉眼能觀察到在小孔內抑制８０％細菌生長的最低 藥物濃度為 ＭＩＣ８０；以肉眼能觀察到在小孔內抑制 ５０％細菌生長的最低藥物濃度為 ＭＩＣ５０。

２ 結 果

對于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞 桿菌，廣西眼鏡蛇蛇毒的抑菌作用最強，五步蛇蛇 毒的抑菌作用次之，銀環蛇蛇毒最弱；對于甲型溶 血性鏈球菌，五步蛇蛇毒的抑菌作用強于廣西眼鏡 蛇和銀環蛇。對于革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、甲 型溶血性鏈球菌和革蘭陰性菌大腸埃希菌、枯草芽 胞桿菌，廣西眼鏡蛇蛇毒對革蘭陽性菌的 ＭＩＣ值均高于其對革蘭陰性菌的 ＭＩＣ值２倍或２倍以上，提 示革蘭陽性菌對廣西眼鏡蛇蛇毒敏感度低于革蘭陰 性菌的。

３ 討 論

實驗結果表明廣西眼鏡蛇蛇毒對金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌、大腸埃希 菌和枯草芽胞桿菌均有不同程度的抑制作用，且作 用較為明顯，推測其主要原因可能為：細胞毒素是 眼鏡蛇蛇毒的主要活性成分，約占蛇毒總蛋白質含 量的４０％，具有較強的細胞毒性。細胞毒素與細 菌的細胞膜結合后，通過改變細胞膜的通透性，造 成細胞膜破損，產生穿孔現象，從而導致細胞膜內 容物外 滲，進 而 使 細 菌 死 亡。與 革 蘭 陰 性 菌相比革蘭陽性菌有較厚的肽聚糖，且革蘭陽性菌的 細胞壁比較厚，這可能是廣西眼鏡蛇蛇毒對革蘭陽 性菌的抑菌效果比革蘭陰性菌差的原因之一。實驗 數據表明五步蛇蛇毒也具有一定的抗菌作用，可能 與五步蛇蛇毒中也含有少量細胞毒素有關，五步 蛇蛇毒對甲型溶血性鏈球菌的抑制作用比較強，原 因有待進一步研究。銀環蛇蛇毒無明顯抑菌作用可 能與其蛇毒成分中以神經毒素為主有關，神經毒素 毒性較強，可有神經肌肉阻斷作用，嚴重時可導致 外周呼吸麻痹引起死亡，但小劑量的神經毒素可 能仍不足以對細菌有抑制作用。