骨肉瘤是起源于間葉組織的惡性腫瘤，患病人 群多集中在兒童、青少年、55 歲以上的中老年人。 骨肉瘤易發(fā)生在血運豐富的長管狀骨干骺端，早期 極有可能發(fā)生肺轉移，且發(fā)展迅速。目前的主要 治療方式為手術切除和化療相結合，但由于復發(fā) 和耐藥發(fā)生率較高，嚴重影響了術后預后。紫草 素屬于萘醌類物質，是紫草中主要活性成分，又稱紫草醌或紫草寧，因具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧 化、神經(jīng)保護、心臟保護、傷口愈合等作用而被廣 泛報道，常用于治療結腸癌、肝癌、神經(jīng)膠質瘤、 關節(jié)炎、哮喘、急性肺損傷等。但紫草素對人骨肉 瘤的抑制活性報道較少。本研究探索紫草素通過調 控內質網(wǎng)應激蛋白誘導人骨肉瘤細胞死亡的作用 及其機制。

1 材料

1.1 儀器

BSA124S 分析天平（德國 Sartoruis 公司）； BSC-1000ⅡA2 生物安全柜（上海博迅實業(yè)有限公司）；HEPA Class100 型二氧化碳培養(yǎng)箱、Easy pure Ⅱ超純水儀、BiofugePrimorcentigge 型高速冷凍離 心機（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；CKX41 倒置顯微鏡（日本 Olympus 公司）；Accuri C6 流式 細胞儀（美國 BD 公司）；SpectraMax Plus 384 酶標 儀（美國Molecular Devices公司）；Mini-Protean Tetra 電泳槽、Mini Trans-Blot 轉印槽、ChemiDOC XRS+ 分子成像系統(tǒng)（美國 Bio-Rad 公司）；上海博迅YXQ-50S11立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業(yè)有限公司）； 化學發(fā)光儀（美國 Turner Designs 公司）。 

1.2 試劑

紫草素（批號 S827904）購自美國 Selleck Chemicals 公司，質量分數(shù) 99.03%；胎牛血清（FBS） （批號 1816937）、Lipofectamine 2000 轉染試劑購自 美國 Thermo Fisher Scientific 公司；RPMI-1640 培 養(yǎng)基（批號 AAF023615）購自美國 GE 生命科學； 細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）（批號 40203ES60）、細 胞凋亡試劑盒（批號 40302ES20）購自上海翊圣生物科技有限公司；人 ATF4（ab184909）、ATF6 （ab62576）、GRP78（ab108615）、IRE1α（ab124945）、 GAPDH（ab181602）單克隆一抗、辣根過氧化物酶 標記的羊抗兔 IgG 二抗（ab6721）均購自美國 abcam 公司；干擾 RNA 訂購于銳博生物科技有限公司； 質粒訂購于通用吉滿生物科技有限公司；海腎熒光素酶報告質粒（E2231）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（E2920）購自美國 Promega 公司。

1.3 細胞

人骨肉瘤 U-2 OS 細胞購自中國科學院細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出凍存的人骨肉瘤 U-2 OS 細 胞，將凍存管立即放入 37 ℃水浴中，輕搖使其迅 速融化，解凍后的細胞置于離心機中 1 000 r/min 離 心 5 min，吸棄凍存液，加入 1 mL 溫熱的 RPMI-1640 完全培養(yǎng)基輕輕吹打，轉入培養(yǎng)瓶中，緩慢補加適 量完全培養(yǎng)基，輕輕搖動培養(yǎng)瓶形成單細胞懸液， 放入培養(yǎng)箱中（37 ℃、5% CO2 濃度、飽和濕度） 培養(yǎng)。待培養(yǎng)基顏色發(fā)生明顯變化后使用移液器吸 棄培養(yǎng)基，溫熱 PBS 潤洗 2 次后加入等體積新鮮培 養(yǎng)基，于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，直至達到實驗所需 細胞匯合度。取匯合度為 80%～90%的生長狀態(tài)良 好的細胞，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入 2 mL 溫熱 PBS 輕輕潤洗 2 次，然后加入 2 mL 溫熱的 0.25%胰蛋 白酶消化細胞，置于培養(yǎng)箱中孵育 2 min，取出放 置于顯微鏡下進行觀察，待細胞形態(tài)由貼壁狀態(tài)下 的梭形逐漸收縮變圓、間隙增大后吸棄消化液終止 消化，加入適量溫熱的新鮮完全培養(yǎng)基，接著用移 液器輕輕吹打貼壁細胞，使之脫落并處于單細胞懸 浮狀態(tài)，計數(shù)后取適量細胞分置于新的無菌培養(yǎng)瓶 內繼續(xù)培養(yǎng)或用于實驗。

2.2 CCK-8 法檢測細胞增殖抑制率

取處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的 U-2 OS 細胞， 0.25%胰蛋白酶消化使貼壁細胞脫落，新鮮完全培104 /mL 的單細胞懸液，以 200 μL/孔的體積接種于 96 孔培養(yǎng)板中，置于 5% CO2 培養(yǎng)箱中 37 ℃孵育 過夜；棄舊培養(yǎng)基，加入等體積一系列濃度梯度 （0.156 25、0.3125、0.625、0.125、0.25、0.5、1、2、 4 μmol/L）紫草素培養(yǎng)基稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后， 于每孔加入 20 μL CCK-8 溶液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù) 孵育 4 h，酶標儀在波長為 490 nm 測定每個孔的吸 光度（A）值，計算不同濃度的紫草素對細胞的抑 制率。實驗重復 3 次，用 Graphpad Prism 5.0 軟件 計算紫草素對受試細胞株的 IC50 值。 抑制率＝（1－加藥孔平均 A 值）/空白對照孔平均 A 值

2.3 紫草素對 U-2 OS 細胞凋亡的影響

取對數(shù)生長期的人骨肉瘤 U-2 OS 細胞，棄去 培養(yǎng)基，PBS 清洗 2 次，胰蛋白酶消化后，用新鮮 培養(yǎng)基收集細胞，計數(shù)，以 1×105 /mL 細胞密度接 種于 6 孔培養(yǎng)板中，每孔 2 mL，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 過夜待細胞貼壁，分別加入 0、1、2、4 μmol/L 紫 草素處理，繼續(xù)孵育 24 h 后，收集各孔細胞上清液， 并使用胰蛋白酶消化細胞，收集細胞置離心管中與 上清液合并，2 000 r/min 離心 5 min，棄上清，重 復一次。往離心管中加入預先配好的 100 μL 1× Annexin V Binding Solution，制成細胞懸液，并依 次加入 Annexin V-FITC 結合物和 Propidium Iodide （PI） Solution 各 5 μL，輕彈離心管混勻試劑，室 溫下避光培養(yǎng) 15 min。最后加入 400 μL 1×Annexin V Binding Solution，使用流式細胞儀進行檢測。

2.4 紫草素對內質網(wǎng)應激蛋白的調控檢測

取對數(shù)生長期的人骨肉瘤 U-2 OS 細胞，常規(guī)消化 后，用新鮮培養(yǎng)基收集細胞，計數(shù)，細胞以 5×105 /孔 接種于 6 孔培養(yǎng)板中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。過夜待細 胞貼壁，分別加入紫草素 0、0.5、1.0、2.0 μmol/L， 繼續(xù)孵育 24 h 后，收集細胞，加入預配制的含 PMSF 和蛋白酶抑制劑混合物的 Western、IP 細胞裂解液， 制備蛋白樣品，BCA 法測定蛋白濃度。制備 10% 的分離膠和 4%濃縮膠對蛋白樣品進行電泳分離， 轉 PVDF 膜，脫脂牛奶封閉 2 h，加入相應的一抗 （1∶1 000）4 ℃孵育過夜，HRP 標記的二抗（1∶ 10 000）常溫孵育 2 h，加入増強型化學發(fā)光液上機， 對內質網(wǎng)應激蛋白的表達進行檢測。

2.5 內質網(wǎng)應激基因敲低和過表達對細胞活力的影響

對數(shù)生長期的人骨肉瘤 U-2 OS 細胞調整濃度 為 2.5×105 /mL 后接種于 6 孔培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)箱中孵育過夜，75 pmol siRNA 寡核苷酸或 4、8 μg DNA 質粒與 Lipofectamine 2000 試劑混合后轉染細 胞，6 h 換液，加入 0.4、0.8、1.6 μmol/L 紫草素繼 續(xù)孵育 48 h，使用 CCK-8 試劑盒檢測細胞活力。

2.6 報告基因檢測

將 ATF4 或空白質粒（3 μg）、GRP78 報告質粒 （3 μg）和海腎內參質粒（4 μg）均勻混合，用 Lipofectamine 2000 試劑對人骨肉瘤 U-2 OS 細胞進 行轉染，6 h 換液，加入 0.8 μmol/L 紫草素繼續(xù)孵 育 24 h，使用溫熱的 PBS 清洗 2 次，按說明書先檢 測螢火蟲熒光，再檢測海腎熒光，實驗結果用各孔 海腎熒光做參比進行校正。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用 Graphpad Prism 5.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處 理，計量資料采用?x±s 來表示，統(tǒng)計方法采用獨 立樣本 t 檢驗或單因素方差分析。

3 結果

流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，紫草素 0～4 μmol/L 作 用 24 h 能濃度相關性地誘導 U-2 OS 細胞凋亡，凋 亡細胞比例分別為 6.30%±0.29%、11.60%±3.21%、 42.70%±8.63%、71.29%±10.75%（與 0 μmol/L 劑 量組比較）。細胞活力實驗檢測顯示，紫草素能濃度相關性 抑制 U-2 OS 細胞活力，與對照組相比有統(tǒng)計學意 義（P＜0.01）。與轉染空白質粒相比，轉染 ATF4 表達質粒可直接促進 U-2 OS 細胞死亡，隨著 ATF4 轉染劑量的增加，細胞活力進一步下降，結果有統(tǒng) 計學意義（P＜0.01）。將 GRP78 啟動子序列后連接螢火蟲熒光素酶 基因，構建 GRP78 報告質粒，海腎熒光素酶作為參比進行報告基因檢測。結果顯示，單獨轉染 ATF4 質粒可促進 GRP78 基因的轉錄，紫草素可增強內 源性或外源性 ATF4 對 GRP78 基因的轉錄促進效 果。與第一組轉染了空白質粒的對照組相比，差異 有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

4 討論

青春期是骨肉瘤的發(fā)病高峰期，男性發(fā)病率高于女性，早期易發(fā)生轉移。現(xiàn)階段骨肉瘤的治療模式是：術前新輔助化療–手術切除–術后輔助化療。化療常用藥物有阿霉素、甲氨蝶呤、順鉑和異環(huán)磷酰胺，通過不同組合聯(lián)合用藥。對于腫瘤 的手術切除，目前更傾向于廣泛切除而非全間室切 除，并保留重要組織，以最大程度維持肢體功能。 該模式在有效降低骨肉瘤的轉移和復發(fā)同時還能 有效提高患者的生活質量。除了易發(fā)生肺轉移外， 骨肉瘤的治療過程還常被突如其來的化療耐藥性阻斷，因此遠期生存率低于 30%。為了改善骨肉 瘤患者預后和生存率，人們從多方面尋找解決辦法，開發(fā)新的治療策略，包括根據(jù)基因測序結果個體化用藥、放射治療、免疫療法和研究新的化療藥 物或耐藥逆轉劑等。

 

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