眼的血 － 視網膜屏障( Blood － retinal barrier，BＲB) 包 括內屏障和外屏障。內屏障由血管內皮細胞之間的緊密連 接( 如粘連小帶和閉鎖小帶) 以及內皮細胞中少量的囊泡 構成; 外屏障由視網膜色素上皮細胞( Ｒetinal pigment epithelium，ＲPE) 之間的緊密連接和色素上皮調節媒介運輸的 不對稱分布的蛋白質構成。由于眾所周知的激光特性 與眼組織結構特點的相互作用，在醫療上，眼科是第一個應 用激光作為治療手段的學科。

1 實驗材料

1． 1 實驗動物

成年健康有色家兔 30 只，體質量 2． 0 ～ 2． 5 kg，雌雄不 限，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供。動物合格證號: 醫動字第 20 － 003 號。

1． 2 藥品及試劑

1． 2． 1 主要藥物

蠐螬酸性水解液制取方法: 蠐螬 400 g ( 湖南東潤聯合醫藥有限公司中藥材部) ，清洗 10 遍以上， 浸泡 1 晚，后洗至無臭味。加蒸餾水 5 kg，加 37% HCl 至 pH 值為 2。高壓蒸汽鍋( 哈爾濱松花江醫療器械廠) 蒸 2 h。紗布( 4 ～ 5 層) 過濾，溶液中加 40% NaOH 至 pH 值為 6． 5 ～ 6． 8。冷卻，隔水加熱，濃縮至 1600 mL( 1 mL 溶液 = 0． 25 g 生藥) 。裝瓶，壓蓋，蒸汽高溫滅菌，冷藏保存。

1． 2． 2 主要試劑

P75NTＲ 一抗( 武漢博士德生物工程有 限公司) 、TrkA 一抗( 武漢博士德生物工程有限公司) 、DAB 顯色試劑盒( 武漢博士德生物工程有限公司) 。

1． 3 主要儀器及器械

眼科手術顯微鏡( 蘇州醫療器械有限公司) 、眼底接觸 鏡( 蘇州醫療器械有限公司) 、YZ/3 三面鏡( 蘇州醫療器械 有限公司) 、YZ5F 裂隙燈照相機( 蘇州醫療器械有限公 司) 、裂隙燈顯微鏡( 蘇州醫療器械有限公司) 、AG204 型電 子天平( 上海梅特勒—托利多儀器有限公司) 、TD5 － Ⅱ臺 式離心機( 長沙平凡儀器儀表有限公司) 、SSW 型電熱恒溫 水槽( 上海博迅實業有限公司) 、721 分光光度計( 上海第三 儀器廠) 、LKB8800 超薄切片機( 瑞典 LKB 公司) 、多功能顯 微鏡( 西德 OPTON 公司) 、Olympus 光學顯微鏡( 日本日立 公司) 、石蠟包埋機( 日本日立公司) 、LeicaMPS30 照相系統 ( 德國 Leica 公司) 、Leica 石蠟切片機( 德國 Leica 公司) 、萊特 532 眼底激光治療儀( 法國光太公司) 。

2 實驗方法

2． 1 激光損傷血 － 視網膜屏障動物模型的建立

參照王曉英、陳少軍等造模方法并加以改進。實 驗動物的準備: 激光照射當日用復方托吡卡胺眼藥水滴眼 2 次。

2． 2 造模方法

兔稱重，固定，20% 烏拉坦 1 g /kg 耳緣靜脈注射全麻， 將兔頭部固定于激光機前，三面鏡置于結膜囊內，以波長 532 nm 的倍頻 Nd: YAG 激光( 光斑直徑 50 μm，能量 110 mw，曝光時間 0． 15 s) 在視盤及有髓神經纖維下視網膜處 密集照射 40 個點，光斑緊鄰，最大間隔為 100 μm。光斑效 應為 3 級( 中度 ～ 重度) : 中心白較濃或更濃，激光能量作用于內核層。

2． 3 動物分組及給藥方法

30 只成年健康有色家兔隨機抽取 10 只( 20 只眼) 作 為正常組，其余 240 只( 40 只眼) 造成激光損傷血 － 視網膜 屏障模型，并隨機分成模型組、蠐螬組，每組 10 只( 20 只 眼) 。 造模后第 2 天開始給藥，正常組與模型組予 0． 9% 生 理鹽水灌胃，5 mL/kg，1 次/d; 蠐螬組予蠐螬提取液灌胃，5 mL/kg，均為 1 次/d( 相當于成人等效最大劑量) 。

2． 4 標本采集方法

連續灌胃 1 周后，各組隨機抽取 5 只兔進行標本的采 集和指標的檢測，各組剩余的兔繼續同法灌胃至第 2 周結 束，再行標本的采集和指標的檢測。

2． 4． 1 眼球壁標本的采集

實驗結束后，動物耳緣靜脈注 射空氣處死，立即沿角膜緣作標記后摘除眼球，生理鹽水沖 洗干凈，在冰生理鹽水中于角膜緣后 0． 5 mm 處剪開眼球 壁，去除眼前節組織和玻璃體，在手術顯微鏡下找到激光斑 所處視網膜，大于激光斑范圍約 3 mm 切除該處眼球壁，用 4% 多聚甲醛在 4 ℃固定。

2． 4． 2 視網膜組織勻漿的采集制作

將依同法摘除的眼 球壁在手術顯微鏡下剝離激光斑部位視網膜，用濾紙吸干 水分，電子天平稱其濕重，再用雙蒸水按照濕重∶ 體積 = 1 ∶ 19 配制成 5% 的視網膜勻漿液。

2． 5 觀測指標及其方法

2． 5． 1 眼底觀察及照相

造模后即刻作眼底照相; 每日灌 胃前用直接檢眼鏡查看眼底，觀察眼底情況，光凝后 7 d、14 d 再次眼底照相。

2． 5． 2 光鏡下 HE 染色觀察

將已經 4% 多聚甲醛固定 12 h 的眼球壁修片，切取激光斑部位視網膜( 正常組切取 相應部位) ，再置于新的 4% 多聚甲醛固定液繼續固定，梯 度酒精脫水，石蠟包埋，切片，經蘇木素伊紅染色( HE) ，封 片后鏡檢，顯微攝影。

2． 5． 3 神經營養因子受體蛋白( TrkA、p75NTＲ) 表達的免疫組化觀察

采用 S － P 免疫組化法檢測視網膜組織的 TrkA、p75NTＲ 表達: 石蠟切片經常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇 脫水后切片，3% H2O2 去離子水孵育 5 ～ 10 min，阻斷內源 性過氧化酶，根據需要對組織切片進行預處理，滴加兔來源 的一抗，37 ℃ 孵育 1 ～ 2 h，PBS 沖洗，2 min × 3 次，滴加山羊抗兔 IgG 抗體 － HＲP 多聚體，37 ℃孵育 20 ～ 30 min，PBS 沖洗，2 min × 3 次，選用 DAB 顯色，蒸餾水充分沖洗，選擇 適當的 封 片 劑 進 行 封 片。陰 性 對 照 省 去 滴 加 TrkA、 p75NTＲ、一抗的步驟，陽性結果為棕黃色。用 HAIPS － 1000 高清晰彩色病理圖像測量系統計算面密度值( 目標面 積/統計場面積) 作為半定量參數，測量 TrkA、p75NTＲ 的表 達。

2． 6 統計學方法

所有實驗數據以均數 ± 標準差( 珋x ± s) 表示，用 SPSS 12． 0 進行統計學處理。先做方差齊性檢驗，方差齊者用單 因素方差分析及 LSD 多重比較。方差不齊者作 Tambane’ sT2 檢驗。

3 結果

造模后各組均有明顯激光斑，某些見出血灶，激光斑中 心顏色呈濃白色，周邊見淺色一圈光暈。7 d 后，蠐螬組激 光斑顏色變淡，中心見色素形成，且邊界清楚，可見少許玻 璃體混濁。14 d 后，蠐螬組激光斑部分轉化為瘢痕組織，范 圍較前明顯縮小。正常組: 視網膜組織結構 完整，層次清楚，細胞排列整齊。光感受器細胞內外節無變 性，內外核層細胞數目多，內外網狀層無水腫，神經節細胞 數目多無空泡樣變性，細胞數目多。

4 討論

中醫認為: 激光致血 － 視網膜屏障損傷主要是由于熱 灼陰津、熱灼血絡，氣津相關，氣能生津、化津、攝津，津能載 氣，若陰津虧耗，無以載氣，則氣失依附而氣散氣耗而致氣 虛; 氣生于精，精化為氣，陰精虧耗必致氣虛; 陰損耗氣而致 氣陰兩虛，氣為血帥，氣行血行，若氣虛運血無力，可致氣虛 血瘀。最終導致視網膜細胞的水腫、滲出、出血甚至壞死， 故治療常以益氣養陰、活血利水為原則。