枸杞是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源性中藥藥材，性甘味平， 滋補(bǔ)肝腎、益精明目。枸杞原漿經(jīng)乳酸菌發(fā)酵不僅會(huì)產(chǎn) 生豐富愉悅的風(fēng)味而讓消費(fèi)者更易接受，同時(shí)乳酸發(fā)酵帶 來的益生作用也提高了枸杞的藥用保健價(jià)值，為枸杞類飲 品市場(chǎng)擴(kuò)展了更大的開發(fā)空間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞（市售寧夏中寧枸杞）；植物乳桿菌 360（Lactobacillus plantarum），四川高福記生物科技有限公司；無 水葡萄糖（食品級(jí)原料），山東保齡寶生物股份有限公司； D- 無水葡萄糖（標(biāo)準(zhǔn)品），中國(guó)藥品生物制品檢定所；硫 酸、苯酚、95% 乙醇、NaCl、MRS 固體培養(yǎng)基成分等試劑， 均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HM-928 料理機(jī)，廣州黑馬電器有限公司；電子天平， 梅特勒 - 托利多儀器（上海）有限公司；HH-4 水浴鍋，常 州國(guó)華電器有限公司；TD5M 臺(tái)式低速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離 心機(jī)儀器有限公司；UV-1800 紫外 - 可見分光光度計(jì)， SHIMADZU CORPORATION；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申 安醫(yī)療器械廠；超凈工作臺(tái)，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司； 恒溫生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；320 pH Meter，METTLER TOLEDO 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵工藝

1.3.1.1 工藝流程

干枸杞→料液比 1:6 →浸提→打漿（添加 5% 葡萄糖） →滅菌（105℃、15min）→冷卻、接種（萬分之八）→發(fā) 酵（37℃、40h）→成品→去籽、調(diào)配飲料。

1.3.1.2 工藝要點(diǎn)

原料處理：挑取顆粒均勻、飽滿的枸杞干果，用水沖洗 兩次以去除表面的雜質(zhì)、灰塵等。 浸泡：以料水比 1:6 的比例，用溫水（40~50 ℃）浸泡 枸杞至變軟。 打漿：將浸泡后的枸杞料液加入 5% 葡萄糖一起進(jìn)行打 漿、破碎。 滅菌：在 105℃下滅菌 15min，滅菌時(shí)間不能過長(zhǎng)，否 則會(huì)破壞枸杞的色澤。 冷卻：采用自來水及時(shí)分段冷卻。 接種：采用植物乳桿菌菌劑進(jìn)行直投式接種，接種量為原漿重量的萬分之八，將稱好的菌劑溶于少量無菌水后投入 原漿中。 發(fā)酵：在 37℃下發(fā)酵 40h，定期取樣。

1.3.2 pH 值測(cè)定

采用 pH 計(jì)進(jìn)行測(cè)定，每隔 4h 取樣。 1.3.3 多糖測(cè)定 采用苯酚 - 硫酸法進(jìn)行測(cè)定，每隔 8h 取樣。

1.3.3.1 對(duì)照品制備

葡萄糖（0.1mg/mL）：準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 25mg，溶解后置于250mL 容量瓶中定容。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0mL 至具塞試管， 分別加水定容至 2.0mL，然后加 1mL5% 苯酚溶液，搖勻后 加入 5mL 濃硫酸（H2SO4）搖勻，靜置 10min。將具塞試 管放入水浴鍋（40℃）保溫 15min，迅速冷卻至室溫，放 置 20min 后在 490nm 下進(jìn)行紫外吸光度的測(cè)定。

1.3.3.3 供試樣品制備

取 50mL 發(fā)酵前后的原漿離心，取上清液 3mL，加 入 30mL95% 乙 醇， 醇 沉 20min 后 離 心，4000r/min 離 心 20min；棄去上清液，用 85% 乙醇進(jìn)行洗滌，最后加水 定容至 25mL；取 200μL 樣品測(cè)定吸光度。

1.3.3.4 樣品多糖測(cè)定

取 200 μL 樣品溶液至具塞試管，分別加水定容至 2.0mL，加 5% 苯 酚 溶 液 1mL， 搖 勻 后 加 入 濃 硫 酸 （ H2S O4）5mL 再次搖勻，靜置 10min；將具塞試管放 入水浴鍋（40℃）保溫 15min，迅速冷卻至室溫，放置 20min；在 490nm 下進(jìn)行紫外吸光度的測(cè)定。

1.3.4 活菌數(shù)測(cè)定

采用平板（MRS 固體培養(yǎng)基）稀釋法，每隔 4h 取樣。

1.3.4.1 樣品處理

取發(fā)酵枸杞原漿 1mL，加入至 9mL 無菌生理鹽水 中，稀釋度為 10-1 樣液，按此方法依次將枸杞原漿稀釋到 10-6、10-7 樣液備用。

1.3.4.2 乳酸菌計(jì)數(shù)

取 稀 釋 度 為 10-6、10-7 發(fā) 酵 枸 杞 原 漿 1000μL 菌 液 涂 布 MRS 固體培養(yǎng)基上，然后置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h，并記錄單菌落數(shù)，同時(shí)計(jì)算出活菌數(shù)。

2 結(jié)果與討論

在整個(gè)發(fā)酵過程中，發(fā)酵原漿的整體 pH 值呈下 降趨勢(shì)——起始 pH 值為 4.92，在 0~8h 之間下降不 明 顯 ，8 ~ 1 6 h 之 間 下 降 幅 度 最 大 ，1 6 h 之 后 趨 于 平 緩 ， 發(fā)酵終點(diǎn)時(shí) pH 值達(dá)到 3.58。究其緣由，主要是因?yàn)?枸杞原漿中的植物乳桿菌利用自身的酶類物質(zhì)、通過 EMP 途徑降解了枸杞原漿中的碳水化合物（如葡萄 糖），進(jìn)而發(fā)酵產(chǎn)生了大量有機(jī)酸（以乳酸為主）， 增加了發(fā)酵原漿的酸度，降低了 pH 值。到終點(diǎn)時(shí) pH 值得變化趨于平緩，主要是由于乳酸菌進(jìn)入衰亡期， 產(chǎn)生的酸有所減少。植物乳桿菌的活菌數(shù)在發(fā)酵過程中的動(dòng)態(tài)變化如，活菌數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間的增加先升高后降低，生長(zhǎng)趨勢(shì) 與束文秀等研究中乳酸菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。在 0~16h 植物乳桿菌的生長(zhǎng)速度較快，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；4h 之 前緩慢增長(zhǎng)，在 12h 時(shí)接近達(dá)到了最高點(diǎn)，活菌數(shù)為 6.84×10 9 cfu/mL；12~28h 時(shí)生長(zhǎng)平緩，處于穩(wěn)定 期；28h 之后下降明顯。究其緣由，主要是由于發(fā)酵 原漿中碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少和代謝產(chǎn)物尤其是酸的 產(chǎn)生影響了乳酸菌的生長(zhǎng)。整個(gè)發(fā)酵過程中，活菌數(shù) 均處于 10 8 cfu/mL 以上，說明枸杞對(duì)植物乳桿菌的 生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

3 結(jié)論與討論

考察了枸杞原漿在發(fā)酵過程中 pH 值、枸杞多糖 和活菌數(shù)的變化規(guī)律。結(jié)果表明，發(fā)酵過程中，pH 值和枸杞 圖 2 枸杞原漿在發(fā)酵過程中的枸杞多糖變化 多糖呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，活菌數(shù)先上升后下降，最終 pH 值達(dá)到3.58、枸杞多糖含量達(dá) 1271.78mg/L、植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá) 2.57×109 cfu/mL。如果將發(fā)酵好的枸杞原漿稀釋 100 倍調(diào)配 成枸杞飲料，其活菌數(shù)仍可達(dá)到≥ 106 cfu/mL 的乳酸菌活菌 飲品標(biāo)準(zhǔn)。