白色念珠菌是一種條件致病性真菌，通常情況 寄生于人體的口腔、腸道、陰道以及皮膚的表面。念 珠菌的存在與機體的微生物（如細菌、病毒等）是處 于共生互利的狀態，但當人體患有某些疾?。ㄈ缒[ 瘤、癌癥、糖尿病等）時，免疫功能的降低易引起菌 群失調，甚至會引起呼吸、消化等功能的異常。近 些年感染系統性白色念珠菌的越來越多，其原因頗 多，例如激素、使用免疫抑制劑包括大量使用一些抗 腫瘤等藥物，致使機體對抗白色念珠菌的感染能 力下降，致使菌群失衡患者的發病率及病死率顯著 上升。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物

四君子湯（人參9 g，白術9 g，茯苓9 g，甘草6 g）， 購買于沈陽市皇姑區成大方圓藥房，依照傳統的方 法將其制成水煎制劑。先將中藥用蒸餾水浸泡 2 h， 加熱煮沸改為文火 15 min，濾出藥液，再次加入蒸餾 水煎 20 min，將 2 次藥汁混勻，放置 4 ℃冰箱。 甘藍洗凈放好，肥豬油用鍋熬制好，放置 4 ℃冰 箱。 氟康唑膠囊，石家莊四藥有限公司產品，批號： H10970299。生理鹽水將其溶解之后制成混濁液， 調整至藥物濃度為 0.4 mg/mL（10 mg/kg）。 白色念珠菌的菌株是由北京大學第一醫院贈 與，Candida albicans（03382 株）。

1.2 實驗動物

小鼠購買于遼寧長生生物科技有限公司的 SPF 級昆明種，實驗動物的生產許可證號為：SCXK（遼） 2010-0001。將購買的實驗動物飼養于具有 SPF 級 動物室的實驗中心內，即遼寧中醫藥大學動物室的 許可證號：SYXK（遼）2013-0009。 1.3 試劑與器材 anti-IFN-γ：abcam 公司產品，批號：ab24979。 Western-blot 試劑均購于碧云天生物技術有限 公司，其中包括：標準蛋白質分子量，批號：P0062； 蛋 白 標 準，批 號：P0007；BCA 蛋 白 濃 度 測 定 試 劑 盒，批 號：P0012；Western 及 IP 細 胞 裂 解 液，批 號： P0013；SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒，批號：P0012A； Western-blot 蛋白上樣緩沖液，批號：P0015L；超敏 ECL 化學發光液試劑盒，批號：P0018；Western- 抗 體稀釋液，批號：P0023A。 電子天平選用上海舜宇恒平科學儀器（JA2003 型），生物安全柜選用青島海爾特種電器（HR40- IIA2 型），上海博迅YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌器，全自動凝膠圖像分析選用上海天能 （Tanon-4200SF 型）。

2 實驗方法

2.1 接種菌液的配制

在高溫高壓滅菌后的沙堡培養基上將白念 珠菌株轉種培養 2~3 次，放入 37 ℃恒溫箱中培養 24 h。選用無菌生理鹽水將其轉種后的念珠菌 進行稀釋，取一滴稀釋好的懸液滴在 16×25 計 數板上，然后進行計數，最終將菌液調整為 2× 108 CFU/mL。

2.2 分組、制造模型及處理方法

正常飼養 1 周后，采用隨機分成法將小鼠分 為 5 組，即空白對照組（A）、脾虛模型組（B）、脾 虛 + 白念珠菌組（C）、脾虛 + 白念珠菌 + 氟康唑 組（D）、脾虛 + 白念珠菌 + 四君子湯組（E），每組 10 只。除空白對照組（A）10 只小鼠以外，其余參 照文獻將采用復合因素法制備脾虛模型，單日 游泳直到耐力極限，身體蜷縮，喂生甘藍，正常飲 水，雙日灌胃豬油 0.5 mL/ 只，連續造模 14 d。參 照脾虛造模診斷的宏觀標準對脾虛模型小鼠 進行評估。若模型小鼠出現體重降低，肛門周邊 有稀便甚至出現便溏，食少納呆，疲乏無力，毛色 枯槁，卷縮扎堆等表現，提示脾虛制造模型成功。 造模成功的次日經口感染白念珠菌懸液給 C、D、 E 組的小鼠 0.5 mL/ 只（濃度為 2×108 只 /mL），而 A、B 組給以 0.5 mL/ 只生理鹽水。

2.3 給藥方法

經口感染白色念珠菌的次日開始灌胃治療，脾 虛 + 白念珠菌 + 氟康唑組（D）小鼠給予氟康唑灌胃 治療，脾虛 + 白念珠菌 + 四君子湯組（E）組小鼠給 予四君子湯灌胃治療。每日 1 次，連續 2 周。

2.4 指標檢測

2.4.1 觀察四君子湯對脾虛小鼠感染白色念珠菌后

小腸組織中IFN-γ含量的影響 治療的第 14 天斷髓處死后取出小鼠小腸的空 腸 段 0.1 g，用 PBS 沖 洗 干 凈，放 置 于 1.5 mL EP 管 中，-80 ℃冰箱凍存備用。提取每組小鼠小腸組織 中總蛋白，采用western-blot法檢測其IFN-γ蛋白含 量的表達。首先檢測其蛋白濃度，根據蛋白濃度，用 上樣液調整好上樣的量，最終蛋白的量為15 μg/孔， 在電壓 80 V/120 V 條件下開始跑膠，大約 2 h 左右， 關閉電源。將蛋白質從凝膠轉移至濾膜上，采用濕 轉，100 V 轉移 1.5 h?？乖贵w∶一抗（1∶500）、二 抗（1∶1500）放置在 4 ℃冰箱里進行孵育過夜后，第 2 天顯色，等體積的 ECL 每膜 1 mL，用自動凝膠圖像 分析系統進行拍攝，測其條帶的灰度值，將其數統計 分析。

2.4.2 觀察四君子湯對脾虛小鼠感染白色念珠菌后

小腸組織中IFN-γmRNA含量的影響 治療的第 14 天斷髓處死后取出每只小鼠小腸 的空腸段 0.1 g，用 PBS 沖洗干凈，放置于 1.5 mL EP 中，-80 ℃冰箱凍存，待檢。對每組小鼠小腸組織中 IFN-γmRNA 的含量選用 RT-PCR 法進行檢測。首 先進行總 RNA 提取，及 RNA 濃度和純度測定，之后 進行 cDNA 的逆轉錄合成和 PCR 反應，最后用瓊脂 糖凝膠進行電泳。將凝膠成像用全自動凝膠圖像分 析系統進行分析，測定每條條帶的積分光密度值，記 錄數據統計分析。2.5 統計學方法 對每組數據選用 SPSS10.0 統計軟件進行分析。 小鼠腸組織當中的 IFN-γmRNA 及蛋白含量采用 x —±s 表示，P<0.05 被認為有顯著性差異。

3 實驗結果

如實驗結果示：與 A 組比較，B 組蛋白表達 水平顯著升高（P<0.05），C、D、E 組小鼠腸組織 當中 IFN-γ 蛋白的含量在治療后均顯著升高 （P<0.01）。 與 B 組 比 較，C 組 小 鼠 小 腸 組 織 中 IFN-γ 蛋白的含量顯著升高（P<0.01），D、E 組小 鼠小腸組織中 IFN-γ 蛋白的含量在治療后均升 高（P<0.05）。與 C 組比較，D 組、E 組鼠小腸組織 中 IFN-γ 蛋白的含量在治療 14 d 后均無統計學 意義。與 D 組比較，E 組小鼠腸組織當中 IFN-γ 蛋白的含量在治療 14 d 后無統計學意義。如實驗結果示：與 A 組比較，B、C、D、E 組小鼠 腸組織當中 IFN-γmRNA 的含量在治療后均明顯 升高（P<0.01），具有統計學意義。與 B 組比較，C、D、 E 組小鼠腸組織中當 IFN-γmRNA 的含量在治療后 均升高（P<0.01），具有統計學意義。與 C 組比較，D 組、E 組小鼠小腸組織中 IFN-γmRNA 表達水平均 無統計學意義。

4 討論

“內傷脾胃，百病由生”，脾居中焦，主運化水谷 精微，氣血生化之源，氣機升降之樞紐。若脾臟 出了問題，即不能化生氣血，升降功能又失調，就會 影響正氣。一些研究者發現，中醫臟象學描述的 “脾”，從它的位置、形態上來看，實際就是我們現代 解剖學中的脾和胰等，而且這些組織和器官都是幫 助機體消化、提高機體免疫功能的器官和組織學基 礎，因此說明脾有防御功能，若脾氣虛弱導致防 御能力下降，則“百病由生”。而脾虛證大多指的 是脾氣功能不足、不能運化、失其健運等。四 君子湯為經典治療脾虛方劑，對于腸道菌群失調研 究也頗多。而目前研究者發現，白色念珠菌的易 感染性與機體的免疫防御功能有關，當機體免疫功 能降低時發生白色念珠菌感染，會引起機體內細胞 因子含量的變化，部分疫功能也受到一定程度的抑制。