檸檬酸（citric acid）又名枸櫞酸，學(xué)名 2-羥基丙 烷-1，2，3-三羧酸，白色晶體，含一分子結(jié)晶水，無(wú)臭， 具有令人愉快的強(qiáng)烈的酸味，入口爽快，無(wú)后酸味，安 全無(wú)毒，被廣泛用作食品和飲料的酸味劑。自 1945 年美國(guó) Miles 公司借鑒深層發(fā)酵青霉素工廠，采用無(wú) 菌空氣供給系統(tǒng)和機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐的成功經(jīng)驗(yàn) 基礎(chǔ)上，首先成功開(kāi)發(fā)了深層發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)檸檬 酸。檸檬酸已成為全球產(chǎn)量和需求量最大的有機(jī)酸 品種。世界檸檬酸工業(yè)的集約化程度非常高，除中國(guó) 外，全球主要的檸檬酸制造商只有 5 家～6 家（美國(guó)、 奧地利、加拿大、巴西等），而中國(guó)的產(chǎn)量為最大，2017 年，全球檸檬酸及其鹽產(chǎn)量達(dá)到 212 萬(wàn)噸，我國(guó)產(chǎn)量達(dá) 到 152 萬(wàn)噸，占全球近 70 %，是檸檬酸主要生產(chǎn)國(guó)和 出口國(guó)。

黑曲霉（Aspergillus niger）zs-10：江蘇國(guó)信協(xié)聯(lián)能 源有限公司天津分公司保藏。

無(wú)水葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、大豆蛋白胨：分析純， 天津市北方天醫(yī)試劑公司；（NH）4 2SO4、KH2PO4、MgSO4、 CaCl2、KCl、FeSO4：分析純，天津市四通化工廠；玉米漿 （試劑級(jí)）：金豐玉米有限公司；糖化酶（100 000 U/mL）： 上海源葉生物科技有限公司；耐高溫的 α-淀粉酶 （20 000 U/mL）：諾和諾德（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；玉 米蛋白粉、麩皮粉、豆餅粉：鄢陵勝源豆業(yè)有限公司。

LS-B50L 型立式壓力蒸汽滅菌鍋、SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠； CX23 型光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS 公司；HZQ-QX 恒溫 振蕩器：中國(guó)哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司； FA2004N 電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；50 L 發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂 （potato dextrose agar，PDA）培 養(yǎng)基：馬鈴薯削皮切塊，稱取 200 g，加入適量蒸餾水煮 沸 30 min，4 層紗布過(guò)濾除渣，取清液加蒸餾水定容 至 1L，加入 2 %葡萄糖充分溶解，加入瓊脂粉 20 g， 121 ℃，20 min 滅菌。制成斜面或平板備用。

由于此前黑曲霉 zs-10 是經(jīng)過(guò) γ 射線（Co60）誘變 后篩選得到的菌株，因此采用高劑量 γ 射線（Co60）進(jìn) 行孢子懸浮液誘變，選用 γ 射線（Co60）處理的劑量分別 為 1 000、1 200、1 400 Gy，其致死率與正突變率見(jiàn)表 1。

由表 1 可以看出，Co60 誘變的致死率和菌種正變率 都隨著處理時(shí)間的增加而升高，在處理劑量為 1 400 Gy 時(shí)，正變率達(dá)到 30.6 %。所以選取誘變劑量為 1 400 Gy。溫度是影響黑曲霉發(fā)酵過(guò)程的一個(gè)重要因素。溫 度過(guò)低，細(xì)胞內(nèi)控制酶合成的關(guān)鍵酶的活性受到抑 制，合成檸檬酸的生物反應(yīng)趨向停滯狀態(tài)，溫度偏高， 可能會(huì)造成微生物細(xì)胞中關(guān)鍵酶的不可逆失活，是微 生物代謝減慢。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的搖床三角瓶發(fā)酵，調(diào)節(jié)合適的發(fā)酵初 始 pH 值十分重要。特別是像檸檬酸發(fā)酵這種以淀粉 作為發(fā)酵原料的發(fā)酵，發(fā)酵液初始 pH 值的高低會(huì)直 接影響到菌體糖化酶的活力，由于檸檬酸發(fā)酵是以玉 米粉為原料的發(fā)酵過(guò)程，屬于邊糖化邊生長(zhǎng)邊產(chǎn)酸的 過(guò)程。

以菌種 zs-10 為出發(fā)株，經(jīng)過(guò) γ 射線（Co60）及亞硝 基胍復(fù)合誘變，得到一株高產(chǎn)檸檬酸且遺傳穩(wěn)定性高的誘變菌株 zs-10-5。通過(guò)對(duì)種子培養(yǎng)條件和發(fā)酵條 件的優(yōu)化，最終發(fā)現(xiàn)種子以豆餅粉為氮源，初總糖濃 度 10 %培養(yǎng) 24 h 左右形成菌絲球性能最好。發(fā)酵最 適溫度 35 ℃，初始發(fā)酵在 pH5~6，以豆餅粉為氮源為 0.8 %，通過(guò) 50 L 發(fā)酵罐進(jìn)行了驗(yàn)證，其發(fā)酵結(jié)果為周期 63 h，產(chǎn)酸 17.94 g/100 mL，發(fā)酵指數(shù)為 2.85 kg/（m3 ·h）， 轉(zhuǎn)化率為 99.7 %。

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