苯甲酰芍藥苷是一種單萜苷類化合物，主要分布 在毛茛科植物芍藥、牡丹等的根部，具有改善心 肌缺血、抗炎、抗病毒、免疫調節(jié)、緩解阿爾茨海 默癥、清除過氧亞硝基等多種藥理作用 。Cheng 等給大鼠灌胃 110 mg·kg-1 的苯甲酰芍藥苷，利用 HPLC 檢測血漿樣品，無法測得原型藥物；周曉雯 等分別給大鼠灌胃和注射苯甲酰芍藥苷，發(fā)現(xiàn)苯甲 酰芍藥苷的生物利用度僅為 1.67%，猜測苯甲酰芍藥 苷灌胃給藥后會在體內迅速發(fā)生代謝轉化，導致其 生物利用度低。

1 材料

1.1 動物

Sprague-Dawley 大 鼠 ， 雄 性 ， SPF 級 ， （230±20）g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許 可證號：SCXK（皖）2017-001。

1.2 藥物及試

苯甲酰芍藥苷（由本實驗室自制， 純度≥ 98%）；芍藥苷（北京世紀奧科生物技術有限公 司，批號：17031901）；肝素鈉注射液（江蘇萬邦生 化醫(yī)藥股份有限公司，批號：1406109）；羧甲基纖 維素鈉（天津市致遠化學試劑有限公司，分析純，批 號：20170801）；胃蛋白酶（上海源葉生物科技有限 公司，批號：Y20M9J56420）；胰蛋白酶[生工生物工 程（上海）股份有限公司，批號：E116BA0104]；氫氧 化鈉（煙臺市雙雙化工有限公司，分析純，批號： 20180201）；磷酸二氫鉀（北京千年健中生物科技有 限公司，分析純，批號：20180112）。乙腈（批號： 18015097）、甲醇（批號：10962907829），色譜純， 德國默克公司；鹽酸（上海博河精細化學品有限公司，分析純，批號：20171006）；甲酸（上海阿拉丁 生 化 科 技 股 份 有 限 公 司 ， 色 譜 純 ， 批 號 ： A1627009）；磷酸（天津市光復精細化工研究所，色 譜級，批號：20170101）。

1.3 儀器

UItiMate 3000 超高效液相色譜系統(tǒng)（LPG3400RS 四 元 泵 ， VWD- 3400RS 檢 測 器 ， TCC3x00RS 柱溫箱，Chromeleon 7 色譜工作站，美國賽 默飛世爾科技公司）；ACQUITY H-CLASS UPLC 超高 效液相色譜系統(tǒng)，Xevo G2 Q-TOF 高分辨質譜儀（美 國 Waters 公司）；H1750R 高速冷凍離心機（湖南湘儀 實驗儀器開發(fā)有限公司）；MTN-2800N 型氮吹濃縮 裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；MixMax 渦旋 振蕩器（合肥艾本森科學儀器有限公司）；JK-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（合肥金尼克機械制造有限公 司）；OHAUS EXPLORER 準微量天平（美國奧豪斯公 司）；BSD-TX318 臺式恒溫振蕩器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

2 方法及結果

2.1 苯甲酰芍藥苷體外代謝轉化研究

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）；流動 相： 0.1%的甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 ~1 min，8%~15% B；1~8 min，15%~18% B；8~10 min，18% ~30% B；10~15 min，30% ~35% B；15~ 20 min，35%~85% B；20~21 min，85%~8% B）；流 速：0.2 mL·min-1 ；進樣體積：2 μL；柱溫：30 ℃。

2.1.2 質譜條件

采用 Waters-Xevo G2 Q-TOF 質譜 儀，配有 ESI 電噴霧離子源，負離子模式下進行檢 測，選用亮氨酸腦啡肽作為校正液。霧化氣（N2）體積 流量：600 L·h-1 ；錐孔氣流量：50 L·h-1 ；脫溶劑氣 溫度：350 ℃；離子源溫度（ESI- ）：110 ℃；錐孔電壓：40 V；離子噴霧電壓（ESI- ）：2.5 kV。MSE：掃 描模式檢測；低能通道碰撞電壓：6 V；高能通道碰 撞電壓：20~80 V；掃描范圍（m/z）：0 ~1 500。

2.1.3 人工胃液及人工腸液的配制

取 2.34 mL 濃鹽 酸 加 水 定 容 至 10 mL 配 制 成 稀 鹽 酸 。 取 稀 鹽 酸 1.64 mL，加水約 80 mL 和胃蛋白酶 1 g，搖勻后， 加水定容至 100 mL，即得人工胃液，pH 值為 1.2。 取磷酸二氫鉀 0.68 g，加水 50 mL 使溶解，用 0.4% NaOH 溶液調節(jié) pH 值為 6.8，另取胰蛋白酶 1 g，加 水使溶解，將兩液混合后，加水定容至 100 mL，即 得人工腸液。

2.1.4 苯甲酰芍藥苷體外孵育實驗

稱取適量苯甲酰 芍藥苷，配制成濃度為 7.5 mg·mL-1 的 0.5% 羧甲基 纖維素鈉混懸液。人工胃液組與人工腸液組各取苯 甲酰芍藥苷混懸液 1 mL，分別加入人工胃液及人工 腸液 5 mL，每組平行 6 份樣品，混勻后將其放入搖床中（37 ℃，轉速 200 r·min-1 ），分別于放入搖床的 0、0.5、1、4、8、12 h 取樣 200 μL，加入 1 mol·L-1 NaOH 調節(jié)溶液 pH 值至 7，加入 1 mL 乙腈混勻，使 酶失活；離心（1 000 r·min-1 ，15 min），取上清液過 0.22 μm 微孔濾膜；用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 法檢 測，采用 MSE 模式采集質譜數(shù)據(jù)，結合牡丹皮質譜 圖庫并利用 UNIFI 系統(tǒng)對采集得到的質譜數(shù)據(jù)進行 自動識別。UNIFI 數(shù)據(jù)庫包括化合物名稱、分子 式、實際相對分子質量、理論相對分子質量、保留 時間、誤差、響應值等。依據(jù)碎片離子峰裂解規(guī) 律、化合物極性大小、數(shù)據(jù)庫信息及相關對識 別出的化合物信息進行鑒定和確認。人工胃腸液孵 育實驗所得總離子流圖見圖 1，說明苯甲酰芍藥苷 在人工胃液和腸液中不發(fā)生代謝轉化。結果只檢測 到苯甲酰芍藥苷原型，未檢測到代謝產物。


3 討論

UPLC-Q-TOF-MS/ MS 測定樣品時，流動相使用乙腈-0.1%甲酸水，得 到的總離子流圖基線平穩(wěn)、峰形較好，且保留時間 穩(wěn)定；但 UPLC 測定樣品時發(fā)現(xiàn) 0.1%甲酸水會使基 線漂移，所以對甲醇-水（含甲酸）、乙腈-水、乙腈水（含磷酸）等流動相系統(tǒng)進行考察， 結果發(fā)現(xiàn)乙腈0.05%磷酸水為流動相時基線不漂移，并且得到的色 譜峰分離度、峰形均較好，且保留時間穩(wěn)定，所以 選擇乙腈-0.05%磷酸水作為 UPLC 的流動相。為確 保色譜峰的保留時間、峰形及分離度穩(wěn)定，每次進 樣前色譜柱以流動相起始濃度平衡 5 min。



 

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