活性污泥法廣泛應用于城市污水處理廠，污 泥是污水處理廠在污水凈化過程中產生的含水率不 同的半固態或固態物質，按泥含水率 80%計，每萬 立方米污水經處理后產生的污泥量為 5~10t，根據統計，污泥處置費用約占污水處理廠投資和運行費 用的 20%~50%。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本文作者實驗室從廢水中分離并保存的解淀粉 芽孢桿菌，命名為 DM1。

1.2 主要儀器和試劑

麥芽糊精，山東西王糖業有限公司；玉米淀粉， 食品級，山東恒仁工貿有限公司；脫脂奶粉，內蒙 古伊利實業集團股份有限公司；可溶性淀粉、胰蛋 白胨、瓊脂粉、酵母浸膏、牛肉浸膏等，生化試劑 BR，國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉、無水乙 醇、丁二酸鈉等，分析純，國藥集團化學試劑有限 公司；酵母浸粉等，生物試劑，北京奧博星生物技 術有限責任公司。 ZQZY-AF8 組合式全溫振蕩培養箱，上海知楚 儀器有限公司；HQ40d pH 計，瑞士梅特勒公司； YXQ-LS-75G 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業 有限公司醫療設備廠；KH-300DE 型數控超聲清洗 器，昆山禾創超聲儀器有限公司；博迅SPX-150B-Z 型 生化培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠； SW-CJ-2FD 潔凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術有限公 司；WGLL-230BE 電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；HH-4 數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司。小型噴霧干燥機，上海鑫翁科學儀 器有限公司。

1.3 培養基

菌株斜面培養基、種子培養基和基礎發酵培養 基均為 LB 培養基。 LB 培養基組成為：10g/L 胰蛋白胨、5g/L 酵母 粉、5g/L NaCl，調節 pH 為 7.2，120℃高壓蒸汽滅 菌 20min。固體 LB 培養基，瓊脂含量為 20g/L。

1.4 菌株

DM1 培養方法 菌種活化方法：將保藏的菌種轉接至斜面培養 基，30℃活化 24h。 種子液培養方法：用接種環挑取 1 環菌泥，接 入裝有 10mL LB 培養基的 50mL 的搖瓶中，30℃活 化 22h。 菌株培養方法：采用裝有 100mL 種子培養液的 250mL 搖瓶培養，接種量 2%，于 30℃、200r/min 培養 48h，獲得發酵液。

1.5 發酵條件的優化

1.5.1 碳源種類

在 LB 培養基和 30℃、200r/min 培養條件下， 在基礎培養基中原有成分不變的前提下，分別添加濃 度均為 10g/L 的乙酸鈉、玉米淀粉、可溶性淀粉、葡 萄糖、丁二酸鈉，選擇最優碳源。每個處理重復 3 次。

1.5.2 碳源濃度的選擇

在 LB 培養基和 30℃、200r/min 培養條件下， 上述篩選得到的最佳碳源，考察其濃度（5g/L、 10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L）對菌株液體 發酵活菌數的影響。每個處理重復 3 次。

1.5.3 氮源種類

在 LB 培養基和 30℃、200r/min 培養條件下， 以可溶性淀粉為碳源，分別添加 10g/L 的硫酸銨、 尿素作為單一氮源及體積比為 1︰1、1︰2、1︰3 的胰蛋白胨和酵母粉作為混合氮源加到基礎培養基 中，篩選最優氮源。每個處理重復 3 次。

1.5.4 氮源濃度的選擇

在 LB 培養基和 30℃、200r/min 培養條件下， 上述篩選得到的最佳氮源，考察其濃度（5g/L、 10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L）對菌株液體 發酵活菌數的影響。每個處理重復 3 次。

1.5.5 接種量

在 LB 基礎培養基、培養時間為 48h 的條件下， 研究接種量 1%、3%、5%、7%、10%、對菌株液體 發酵的影響。每個處理重復 3 次。

2 結果與討論

2.1 發酵條件的確定

2.1.1 發酵時間

發酵時間分別為 24h、36h、48h、60h、72h 時， 對應的活菌數分別為 8.1×107 CFU/mL 、 2.68× 108 CFU/mL、3.8×108 CFU/mL、3.3×108 CFU/mL、 2.6×108 CFU/mL，活菌數在 48 h 時達到最大值，故 選擇 48 h 作為發酵時間。

2.1.2 碳源種類

由圖 1 可知，不同種類的碳源對解淀粉芽孢桿 菌活菌數的影響很大（P＜0.05），其中可溶性淀粉、 玉米淀粉能明顯促進菌株生長，乙酸鈉、丁二酸鈉 對菌株 DM1 生長影響不明顯（P＞0.05），葡萄糖不 利于菌株生長（P＜0.05）。可溶性淀粉為菌株最佳 碳源。

2.1.3 可溶性淀粉濃度的優化

可溶性淀粉濃度分別為 5g/L、10g/L、15g/L、 20g/L、25g/L 及 30g/L 時，菌株 DM1 活菌數從 3.2×108 CFU/mL 、依次降至 2.35×108 CFU/mL 、 2.2×108 CFU/mL、2.4×108 CFU/mL、2.0×108 CFU/mL、 2.1×108 CFU/mL。5g/L 為可溶性淀粉最優添加濃度， 此時活菌數達到最大值。


2.1.4 氮源的篩選

由圖 2 可知，不同氮源對 DM1 菌株活菌數具 有顯著的影響（P＜0.05）。當酵母粉︰胰蛋白胨= 2︰1 時，DM1 菌株活菌數均達到最大值；其次是 酵母粉︰胰蛋白胨=1︰1，當酵母粉︰胰蛋白胨= 3︰1 時，與空白對照相比，活菌數略微降低，硫酸 銨、尿素不利于菌株生長（P＜0.05）。以酵母粉︰ 胰蛋白胨=2︰1 作為優選氮源。

2.1.5 優選氮源濃度的優化

按照 2.1.4 節中研究結果，以酵母粉︰胰蛋白 胨=2︰1 作為氮源，考察不同的氮源濃度對菌株 DM1 發酵培養的影響（圖 3）。隨著氮源濃度的增 加，菌株的活菌數呈現先增大后減少的趨勢，在氮 源濃度為 10g/L 時，活菌數達到最大值。當氮源濃度 ≥15g/L 時，活菌數迅速下降。優選的氮源濃度為 10g/L。

2.1.6 接種量

不同接種量對菌株發酵影響。在接種量 為 7%時，活菌數達到最大，為 6.5×108 CFU/mL。 故選擇 7%為最優接種量。

2.1.7 菌懸液的制備

采用上述實驗篩選獲得的條件，即 5g/L 可溶性 淀粉、10g/L 氮源（酵母粉︰蛋白胨=2︰1）、接種 量 7%、搖瓶裝液量 40%，搖床 200 r/min、30℃條 件下搖瓶發酵 48h 制備菌液，菌液活菌數為 8.3× 108 CFU/mL，明顯優于優化前的 3.8×108 CFU/mL。 菌懸液獲取方法：發酵液在 4000r/min 條件下離心 10min，棄上清，得菌泥。使用滅菌后生理鹽水將 菌泥配成活菌數約為 1×109 CFU/mL 的菌懸液。

3 結論

在搖瓶發酵條件為 5g/L 可溶性淀粉、10g/L 氮源（酵母粉︰蛋白胨=2︰1）、接種量 7%、搖瓶裝 液量40%，搖床200r/min、30℃條件下搖瓶發酵48h， 菌液活菌數為 8.3×108 CFU/mL。當進風溫度 180℃、 熱風流量 315m3 /h、進樣速度 500mL/h、麥芽糊精 濃度 5%條件下，解淀粉芽孢桿菌菌粉活菌數可達 1.28×1010CFU/g。



 

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